《五号特工组2》延续前作风格，故事背景设定在抗日战争时期。马云飞、欧阳剑平、何坚、酒井美惠子等五号特工组核心成员再度集结，他们肩负着阻止日军阴谋、获取重要情报等艰巨任务。在一次行动中，特工组得知日军企图研制一种新型生化武器，此武器一旦成功，将给中国军民带来巨大灾难。于是他们深入敌占区，与狡猾凶残的日本特务斗智斗勇。马云飞凭借出色的身手和智慧，多次化险为夷；欧阳剑平冷静沉稳，负责统筹策划；何坚古灵精怪，总能在关键时刻发挥作用；酒井美惠子虽曾是日本特工，但弃暗投明后也为团队贡献力量。他们历经重重困难，成功破坏了日军的生化武器计划，为抗战胜利做出重要贡献。